欢迎来到安徽欣乐生物技术有限公司!

全国服务热线:0551-63658727

科研服务 / Scientific research and service

热点追踪:    热烈庆祝我公司成功入选安徽大学亚博体育官方在线材料采购平台定点供应商

稳转细胞系建立

促销价
¥2000.00 ¥2000.00
标本
收藏
  • 产品说明
  • 亚博体育官方在线简介

    细胞转染是指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等,理想的转染方法是具有高转染效率、对细胞毒性作用小等。其中脂质体转染是亚博体育app官方下载苹果的简便转染方法。

    脂质体(liposome转染方法的原理在于阳离子脂质体表面带正电荷能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹,形成DNA-脂复合体,被表面带负电荷的细胞膜吸附。再通过膜的融合或细胞的内吞作用,偶尔通过直接渗透作用,将DNA转运至细胞内,形成包涵体或进入溶酶体。当DNA从包涵体内释放后进入细胞质再进一步进入核内实现转录表达

    细胞感染是指通过病毒载体将外源分子导入真核细胞。因病毒可以通过自身的侵袭作用进入宿主细胞后,可以利用细胞中的物质和能量以及复制、转录和转译的能力,按照自身核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。利用这种特性,去掉病毒的致毒基因并将外源基因片段插入制成病毒载体,进而将目的片段转入受体细胞,使目的基因可以表达,甚至将基因遗传给后代稳定的表达。目前常见用于转染的病毒有,慢病毒,逆转录病毒,腺病毒等。

    二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞亚博体育官方在线步骤(以6孔板为例)

    1  转染前一天接种细胞于6孔板,5×104每孔,第二天转染时细胞汇合度达到60%-70%每孔。

    2  转染前半小时将完全培养基换无血清培养基1.9 ml。  

    3  A液:RNA 100 pmol/DNA 2μg (根据核酸类型不同,用量不同)加入50 ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静置5min

    4  B液:脂质体使用前轻轻混匀,脂质体5ul 加入50 ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静置5min。  

    5  B液加入到A液中,用枪轻轻混匀,室温静止20min

    6  将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中,边滴加边前后左右十字交叉轻轻摇晃。  

    7  孵箱37℃培养4~6h,然后将无血清培养基换成完全培养基继续培养。

    8  mRNA 水平的检测:在转染后24-48h后,用Real-time PCR的方法在mRNA水平进行检测。

    9  蛋白水平的检测:在转染后48-72h后,用Western-blot或免疫组化的方法在蛋白水平进行检测。

    三、细胞感染亚博体育官方在线步骤(以慢病毒感染为例)

    1转染前一天,2-3×105cells/well的细胞接种在6孔板上,培养24h后将原有培养基弃去,加入2mL的细胞完全培养基。

    2置于CO2浓度为5%的培养箱中于37培养至细胞汇合达到40-60%

    3细胞换液,将病毒液与终浓度5μg/ml polybrene加入新鲜培养基中。8-12h后观察细胞状态,若细胞状态无明显病变,继续培养,24h后更换新鲜培养基。

    4、根据公式计算病毒用量 (细胞数×MOI/病毒原液滴度)×103=病毒用量(μl

    572-96h察荧光表达情况,对生长代谢缓慢的细胞,可适当延长观察时间,并及时换液和传代维持细胞生长状态。

     

    注意:感染细胞最佳MOI的测定:MOI(感染复数)是指每个细胞感染的病毒数。通常MOI高,病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞,例如HeLa293细胞,MOI=1-3时,80%以上细胞均表达目的基因。而对于非活跃的细胞,如原代细胞,感染效率较低,需要进行MOI浓度摸索亚博体育官方在线,选择合适的MOI后再进行后续亚博体育官方在线。


    服务项目

    产品

    0551-63658727

    立足新起点,开创新局面

    Copyright安徽欣乐生物技术有限公司  版权所有 @ 2018 . All rights reserved. 

    图库

    关于我们

    24小时客户服务热线

  • 电话直呼

  • 0551-63658727
  • 欣乐客服 :
  • 扫一扫 关注微信公众号

  • 技术支持: 安徽阿里环维网络科技有限公司 | 管理登录
    ×